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terça-feira, 5 de maio de 2009

Graviola - Estudo Científico


Avaliação da Capacidade Antioxidante dos Extratos e suas Frações, de Graviola
(Annona Muricata), Pau D'arco (Tabebuia Avelanedae), Pariparoba (Pipper Regnelli)

Autores: Ana Celia Ruggiero, Maria de Fatima Nepomuceno, Adriana Mendes Aleixo, Cibeli Ferelli, Paula n Dedalo, Guilherme Mei Silva, Claudia j a Avanzi, Adriana Grandis, Sabrina Condiev
Apoio Financeiro: Fap

1. Introdução
O uso de plantas medicinais contribui com o cuidado primário à saúde. A flora brasileira é rica em plantas medicinais empregadas para grande número de doenças. A graviola (Annona muricata) possui um grupo de fitoquímicos denominados acetogeninas e várias delas são bem documentadas como antitumorais. As acetogeninas atuam como inibidores do complexo I da cadeia de transporte de elétrons nas mitocôndrias de vários organismos, inclusive em células tumorais, levando à depleção dos níveis de ATP (Alali et al. 1999). O pau d’arco (ipê roxo) de várias espécies de Tabebuia entre elas a T. avellanedae, tem sido utilizado no Brasil como antifúngico, antimutagênico, contra o câncer, doença de Hodgkin, leucemia entre outras. O lapachol, principal constituinte químico do ipê-roxo, apresentou atividade contra diferentes tipos de tumores bem como a b -lapchona, e seu mecanismo de ação parece estar relacionado com as espécies reativas de oxigênio além de induzir a apoptose em células tumorais (MULLER et al. 1999). Entre as plantas da família Piperaceae, particularmente as Pariparobas (Photomorphe umbellata L. Miq. e Piper regnellii), são amplamente usadas contra doenças do fígado. Investigações fitoquímicas feitas com as espécies Piper revelaram o acúmulo de várias classes de produtos naturais com atividade fisiológica como alcalóides, amidas, pironas, desidrocalconas, flavonóides, fenilpropanóides, lignanas, neolignanas, terpenos, esteróides, chalconas, flavonas e flavanonas.
2. Objetivos
O projeto teve como objetivo avaliar a capacidade antioxidante de extratos de plantas utilizados na medicina popular tradicional, a graviola, o ipê roxo e a pariparoba. Através de diferentes técnicas buscou-se caracterizar o mecanismo da atividade antioxidante.
3. Desenvolvimento
Os extratos vegetais da casca do pau d´arco (Tabebuia avellanedae), das folhas de graviola (Annona muricata ) e da pariparoba (Piper regnellii) foram elaborados com cascas adultas frescas e folhas adultas frescas das duas plantas. O pó de cada delas foi submetido à extração dos princípios ativos naturais através da técnica de maceração e percolação com solução etanol/água 70%.
Para separação de substâncias através de suas polaridades, os extratos hidroalcoólicos foram submetidos a processo de partição com hexano, acetato de etila e clorofórmio.
Cada extrato orgânico fracionado em coluna cromatográfica, utilizando como fase estacionária sílica gel e vários eluentes. Os compostos isolados foram submetidos à cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massa para identificação e aqueles com alto grau de pureza foram submetidos à ressonância magnética nuclear de próton (R.M.N.1H) e ressonância magnética nuclear de carbono (R.M.N.13 C) para elucidar a estrutura química. Todas essas análises foram feitas no Instituto de Química da UNICAMP.
Determinou-se a quantidade de compostos fenólicos através do reativo de Folin-Ciocaulteu e como referência o ácido gálico. A capacidade de doar hidrogênio para radicais estáveis foi avaliada através da cinética de decomposição de ABTS (ácido 2,2’-azinobis-(3- tilbenzotialzolina)-6sulfônico) e de DPPH (2,2-difenilpicrilhidrazil). Avaliou-se ainda a capacidade de seqüestrar o ânion superóxido (gerado pelo sistema xantina/xantina oxidase) e a capacidade de quelar íons FeII. Através da oxidação da desoxiribose determinou-se a capacidade de seqüestrar os radicais hidroxila e a capacidade pró-oxidante. Os experimentos com os extratos orgânicos foram realizados em função da solubilidade destes, nos meios reacionais Todos os valores apresentados representam a média e o desvio padrão, de pelo menos 3 experimentos em duplicata (n=6).
4. Resultados
No extrato clorofórmico de pau d’arco determinou-se 3,3% de compostos fenólicos e 6,6 % no extrato metanólico.
A fração clorofórmio do extrato de ipê apresentou, a partir da concentração 0,05 mg/mL, capacidade de quelar os íons FeII e capacidade de sequestrar o radical superóxido, cerca de 50% de inibição nas concentrações de 0,10 – 0,50 mg/mL
Com o extrato hexânico de ipê-roxo, avaliou-se o efeito contra a peroxidação lipídica induzida por hidroperóxido de cumeno em suspensões de eritrócitos, e observou-se cerca de 20% de proteção em relação ao controle oxidativo, nas concentrações de 1,0 a 2,0 mg/mL. Na decomposição do DPPH o extrato hexânico apresentou capacidade de interagir com o radical na concentração de 1,00 mg/mL.
O extrato metanólico de pau d’arco apresentou proteção contra a peroxidação lipídica induzida por peróxido de hidrogênio, capacidade de decompor o radical de ABTS, cerca de 50% na concentração de 1,0 mg/mL e nenhum efeito foi observado na capacidade de seqüestrar os radicais hidroxila e superóxido e nem atividade quelante. Essa fração apresentou apenas capacidade redutora.
Foram fracionados os extratos orgânicos da casca do ipê roxo (hexânico e clorofórmico). Para extrato hexânico foi possível o isolamento de 3 compostos que foram submetidos à análise de RMN1H e RMN13C.
A repurificação das amostras obtidas do extrato orgânico clorofórmico do pau d'arco forneceu um composto puro referente à fração menos polar. A fração foi submetida à análise por RMN 1H e RMN 13C e pode-se verificar que se trata de um composto com 10 carbonos e com estrutura de epoximonoterpeno.
Os extratos de folhas de graviola possuem, em média 6,8% de compostos fenólicos na fração metanólica e 14% na fração acetato de etila.
O extrato metanólico de folhas de graviola foi capaz de interagir com o radical de ABTS nas concentrações de 0,50 e 1,00 mg/mL . Não apresentou capacidade de sequestrar o ânion superóxido, mas a partir da concentração de 0,25 mg/mL foi capaz de quelar os ions FeII e na concentração de 1,0 mg/mL capacidade de reduzir os íons FeIII.
Quanto à fração acetato, pôde-se observar que o extrato apresentou capacidade antioxidante na cinética de decomposição do DPPH nas concentrações de 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL. Observou-se ainda capacidade de quelar os íons ferro, de seqüestrar os radicais hidroxila e de reduzir os íons FeIII, mesmo em baixas concentrações de extrato e ainda pequena capacidade de seqüestrar o radical superóxido.
O extrato hidroalcoólico de folhas de pariparoba contém cerca de 3,0% de compostos fenólicos. Não protege contra a peroxidação lipídica induzida por hidroperóxido de cumeno e protege contra a peroxidação lipídica induzida por H2O2. Na cinética de redução do ABTS apresentou índice de proteção de cerca de 30% na concentração de 1,0 mg/mL e não foi capaz de seqüestrar os radicais hidroxila e superóxido. Também não apresentou atividade quelante, mas apresentou atividade redutora.
O extrato hidroalcoólico quando submetido à partição líquido-líquido forneceu os extratos orgânicos com hexano e acetato de etila que foram submetidos à purificação em coluna cromatográfica.
Para o extrato hexânico foi possível o isolamento de um composto puro cujo espectro de RMN1H, apresentou deslocamentos químicos de prótons olefínicos e prótons ligados a carbonos saturados CH2 e CH 3, respectivamente. Já a RMN13C apresentou sinais relativos a um único composto. Através da análise desses espectros pode-se verificar que o composto pode ser um terpeno com carbonos insaturados.
Para a fração de acetato de etila foram obtidos três compostos e os menos polares estavam puros. O RMN1 H, para a mancha menos polar, revelou a presença de prótons de anel e prótons olefínicos ligados a heteroátomo além dos demais sinais característicos de carbonos metilênicos. O RMN13C apresentou sinais relativos a um único composto e verificou-se que composto menos polar está totalmente puro e apresenta esqueleto de composto fenilico com cadeia lateral altamente insaturada.
No RMN1H a mancha de polaridade intermediária apresentou prótons de anel aromáticos, prótons olefínicos e prótons ligados a heteroátomo (dioxóis) além dos sinais de deslocamentos característicos de carbonos metilênicos e metínicos. O RMN13C apresentou sinais relativos a um único composto.
As estruturas da fração acetato são bem típicas do gênero Piper regnellii, e pelo apresentado na literatura tratam-se de compostos inéditos.
Dos sinais observados nos espectros de 2 compostos menos polares foi possível verificar a presença de hidrocarbonetos saturados de baixo peso molecular e de hidrocarboneto insaturado. O espectro de RMN 1H indicou a presença de prótons olefínicos e prótons de metilas ligadas à duplas olefínicas. O extrato clorofórmico do ipê forneceu um composto puro e análise dos espectros de RMN 1 H indicou a presença de prótons olefínicos e prótons de metilas ligadas à duplas olefínicas e prótons ligados a carbonos saturados CH2 e CH 3. O RMN13 C apresentou sinais relativos a um único composto, carbonos metínicos vizinhos à carbonilas, carbonos ligados à heteroátomo (O ou N) e de carbonos olefínicos além do sinal referente à carbonila. Os deslocamentos são coerentes com estruturas de terpenos oxigenados.
5. Considerações Finais
Dos resultados obtidos com os extratos de casca de de ipê-roxo pode-se concluir que os fitoquímicos da fração clorofórmica tem atividade antioxidante impedindo o progresso das reações, os componentes do extrato metanólico atuam reduzindo os radicais formados. Os resultados obtidos com esses dois extratos permitem concluir que o mecanismo antioxidante é como finalizadores das reações em cadeia, pela doação de hidrogênio para os radicais formados.
O extrato hexânico, devido a sua baixa polaridade não pôde ser avaliado em todas as metodologias e, portanto não foi possível concluir sobre o mecanismo da atividade antioxidante.
Com os extratos de folhas de graviola, pode-se concluir que os fitoquímicos presentes podem efetivamente seqüestrar os radicais, mas provavelmente não tem capacidade de doar hidrogênio (baixa capacidade de decompor o radical de ABTS). Esses compostos podem atuar como antioxidantes interrompendo o processo pela habilidade em seqüestrar os radicais formados ou mesmo os íons metálicos, catalisadores do processo radicalar. Por outro lado, devido a essa habilidade, podem também atuar como pró-oxidantes, ao doar elétrons se tornam oxidantes.
Na avaliação do extrato hidroalcoólico de folhas de pariparoba observou-se efeito contra a peroxidação lipídica induzida por peróxido de hidrogênio, evidenciando o acesso dos componentes do extrato, devido a sua hidrossolubilidade, à região polar. Os resultados obtidos aqui permitem concluir também que os compostos apresentam atividade antioxidante doando hidrogênio ou elétrons para os radicais formados e é também possível concluir que a ação pró-oxidante do extrato pode ocorrer em função de sua baixa capacidade de quelar metais e a capacidade de doar elétrons.
A solubilidade é um fator determinante para o acesso aos sítios de geração e/ou de propagação dos radicais livres e a polaridade dos diferentes extratos e seus efeitos nas diferentes metodologias testadas depende da capacidade dos fitoquímicos em atingir os sítios gerados das espécies radicalares.
Na seqüência das purificações dos extratos orgânicos, realizou-se a repurificação das amostras do extrato bruto clorofórmico da casca do pau d’arco. Desse modo, foi possível o isolamento de 4 compostos puros, dos quais dois deles quando submetidos à análise de RMN1H e 13C mostraram ser o mesmo composto e tiveram parte da sua estrutura determinada.
Na continuidade das repurificações um terceiro composto pôde ser isolado e a análise de RMN1H e 13C mostrou ser o mesmo composto obtido da fração hexânica caracterizado como um epoximonoterpeno.
A purificação das frações hexânica e acetato de etila provenientes do extrato hidroalcoólico das folhas da pariparoba forneceram quatro compostos puros que quando submetidos à análise de RMN1H e 13C tiveram parte da sua estrutura determinada.
Estudos bidimensionais de COSY e HETCOR para os compostos puros provenientes da fração acetato (m1 e m3) estão sendo feitos na tentativa de elucidação total de sua estrutura e serão analisados em novos projetos.

Referências Bibliográficas
ALALI,F.Q. et al. Annonaceous acetogenins: recent progress. J. Nat.Prod.62: 504-540, 1999.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M. Free radicals in biology and medicine. N.York: Oxford University.
1999.
MULLER,K.; SELLMER,A.; WIEGREBE,W. Potencial antipsoriatic agents: lapachol compounds as potent inhibitors of HaCaT cell growth. J. Nat. Prod. 62:1134-1136, 1999.
Documentário Globo Repórter:
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3 comentários:

  1. Por quê será que não destacou tanto sobre a graviola??

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  2. Tenho um filho com cancer que se trata com relativo sucesso noINCA do RJ. Os médicos de lá recomendam que "não podem tomar nadfa que não seja receitado por eles. Como eles são excepiconais na oncologia e sou testemunha pq frequento lá, verdadeiros milagreiros e muito corretos e honestos , fico com a opinião deles

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    Respostas
    1. Realmente os médicos não prescrevem algo que não conhecem e também que ainda não tenha estudos científicos suficientes... Isso é precaução e eles tem razão em parte... Não estou me referindo à graviola, mas há muitos suplementos super benéficos, como ômega-3, clorofila, probióticos, etc, que se vc perguntar para o médico ele não recomenda, simplesmente por não conhecer seus benefícios.
      Meu filho também é portador de um câncer e toma vários suplementos há mais de 5 anos, que só tem melhorado e beneficiado sua saúde. Como o tipo de tumor do meu filho não responde à radio e quimio, decidi fazer dessa forma por conta própria, após intensa pesquisa.Se está dando certo, vou continuar, independente do médico recomendar ou não.
      É bom lembrar que os médicos não são Deus e podem errar e por isto que tento ser flexível em tudo. Infelizmente nem todos os tipos de câncer tem cura, mesmo fazendo todo o tratamento proposto. Nestes casos, privar o paciente de buscar outras alternativas é crueldade.
      Fica com Deus e que tudo continue dando super certo e seu filho alcance a cura completa!
      abraço!

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